基于单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析方法定量检测HBeAg阳性患者前C区变异株

作者：涂文辉; 侯伟; 张瑾; 吕莹; 王瑾瑜; 张咏梅; 张轶俊; 刘红艳; 朱浩翔; 秦艳丽; 毛日成; 张继明

来源：肝脏, 2013, (05): 297-302.

• 乙型肝炎病毒
• 单标记探针
• 熔解曲线分析
• 前区变异
• 定量检测 Hepatitis B virus
• Simpleprobe
• Melting curve analysis
• Precore mutations
• Quantitative assay

目的建立一种HBV复杂前C区变异株精确定量的检测系统。方法分两步实时PCR完成检测。首先应用野生株阻断探针(WT-blocker probe)进行选择性抑制野生株病毒的扩增,而含量偏低的变异株病毒得以扩增约10000倍,使其在后续反应中易于检出;第二步应用单标记探针(Simple Probe)结合熔解曲线分析系统精确定量检测前C区G1896A、G1899A、G1896A/G1899A变异株。通过PBPPO(primer-blocker-probe partial-overlap)设计减少基因多态性对检测的影响,来提高检测精确度。检验结果经直接测序及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法予以证实。结果 4种标准质粒(G1896/G1899、G1896A、G1899A、G1896A/G1899A)能够很好地被检出并予以区分,突变检测灵敏度达到0.01%;10例HBeAg阳性(直接测序法鉴定前C区变异阴性)患者血清标本中,每例至少1种前C区变异株被检出。结论单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析能够早期灵敏检测前C区变异株,前C区变异株进化过程及机制还需进一步大样本、纵向队列研究予以阐明。

• 单位
  复旦大学