重组IL-12表达载体构建及对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的调节与免疫应答影响

摘要

目的:构建携带IL-12重组基因的真核表达载体,探讨其对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的免疫调节作用及其可能机制。方法:PCR扩增mIL-12基因cDNA,利用DNA重组技术将线性化片段定向插入载体pcDNA3.1(+)质粒中,经酶切和测序鉴定,通过脂质体介导瞬时转染P815细胞,观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位。以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立妊娠期哮喘小鼠模型,通过气道内灌注:妊娠期哮喘(AP)+pcDNA3.1(+)-mIL-12组(AP1组)、单纯哮喘(ANP)+pcD-NA3.1(+)-mIL-12组(ANP1组)给予50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/脂质体混合液;AP+pcDNA3.1(+)组(AP2组)、ANP+pcDNA3.1(+)组(ANP2组)给予50μl pcDNA3.1(+)/脂质体混合液;单纯妊娠组(HP组)、阴性对照组(HNP组)给予50μlPBS。于末次激发24小时后,观察肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞计数及肺组织HE染色以评价小鼠气道炎症程度;RT-PCR、Western blot鉴定小鼠肺组织匀浆中IL-12蛋白及mRNA表达;流式细胞术检测小鼠脾细胞IL-17+及IFN-γ+分泌水平;ELISA测定小鼠外周血上清中细胞因子含量变化。结果:成功构建重组pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达载体,并在P815细胞中获得高效表达。与HP、HNP组相比,AP1、ANP1组BALF中白细胞总数及Eos,Neu,Lym占细胞总数百分比均显著低于AP2、ANP2组,但高于HP和HNP组,AP1与ANP1组间尤以AP1组降低显著(P<0.05),且肺组织炎症细胞浸润明显减轻,炎症反应明显轻微。肺组织标本中,AP1、ANP1组IL-12蛋白含量及mRNA表达水平在重组质粒干预后显著高于AP2、ANP2组。脾组织标本中AP1、ANP1组IFN-γ+含量明显升高,而CD4+IL-17+明显降低(P<0.05);IFN-γ+与CD4+IL-17+比例高于AP2、ANP2组(P<0.05);此变化趋势AP1组比ANP1组更为明显(P<0.05);HP组IFN-γ+及IL-17+含量变化与HNP组组间差异不显著。外周血上清中细胞因子检测结果 AP1、ANP1组IFN-γ明显升高,IL-4、IL-17显著降低(P<0.05)。结论:构建的pcD-NA3.1(+)-mIL-12真核表达载体能够...

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