基于Gateway~(TM)系统Dec1慢病毒表达载体的构建

摘要

目的利用GatewayTM技术构建分化型胚胎软骨发育基因1(Dec1)的慢病毒表达载体并建立稳定表达该目的基因的人胶质瘤U87细胞株。方法从人脑胶质瘤组织中提取总RNA,经反转录得到目的 cDNA。设计含有特异性酶切位点的引物,通过逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR),获得用于重组的Dec1目的基因全长。将目的片段克隆至入门载体(pENTRTM3C)中产生入门克隆。利用GatewayTM技术,将入门克隆中的目的片段转接于目的载体(pLenti6.3/V5-DEST)中产生表达克隆pLenti6.3-Dec1。在293T细胞中包装慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1并转染U87细胞,通过灭瘟素筛选、Western blot鉴定,获得稳定表达Dec1的U87细胞株。结果 Dec1基因全长的获取与慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1的构建经PCR和测序得到证实。用pLenti6.3-Dec1转染U87细胞后,通过灭瘟素筛选,获得稳定表达Dec1的U87细胞株。结论成功构建了pLenti6.3-Dec1慢病毒表达载体并建立稳定表达Dec1的人胶质瘤U87细胞株,为深入研究Dec1分子机制奠定了基础。

关键词