鸡源CD40L基因克隆、蛋白表达及生物活性检测

摘要

为获得鸡源CD40L（chCD40L）蛋白，以鸡脾细胞制备cDNA并以之为模板扩增chCD40L基因，构建pFastBac-chCD40L供体重组质粒，转化感受态细胞DH10Bac，通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒，转入真核表达系统sf9昆虫细胞进行蛋白表达与纯化，获得His-chCD40L蛋白。此外，构建pQM01-chCD40L质粒，转染HEK293T细胞进行蛋白表达与纯化，获得Strep-chCD40L蛋白。亲和层析纯化的chCD40L蛋白浓度为0.01 mg/mL。为检测chCD40L蛋白生物活性，分离和培养3周龄SPF雏鸡的法氏囊组织原代细胞，将chCD40L加入细胞培养液刺激细胞增殖，通过Western blotting试验、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测，发现该蛋白能够与法氏囊B淋巴细胞表面的CD40结合，说明chCD40L具有生物活性。成功获得chCD40L蛋白，为原代B淋巴细胞体外培养及IBDV野毒分离与诊断奠定了基础。

关键词