3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能的鉴定

作者：刁艳君; 刘家云; 马越云; 苏明权; 郝晓柯

来源：中国肿瘤生物治疗杂志, 2013, (02): 201-206.

• TAT
• DRBD
• 融合蛋白
• siRNA
• 前列腺癌
• 结合活性
• 穿膜功能 TAT
• DRBD
• fusion protein
• siRNA
• prostate cancer
• binding activity
• membrane-penetrating function

目的:构建3TAT-DRBD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其siRNA结合活性和穿膜功能进行初步验证。方法:采用基因合成技术获取靶基因3TAT-DRBD,并克隆到原核表达载体pET-44b中;用IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定。凝胶迁移阻滞实验验证DRBD和siRNA的结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力。结果:限制性酶切和基因测序表明重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD构建成功;IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白(含Nus标签和S标签)在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白约80%;成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子质量约为17 000;凝胶迁移阻滞实验证明,融合蛋白3TAT-DRBD能有效结合靶向survivin基因的siRNA(survivin-siRNA);激光共聚焦显微镜下可见,在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌PC3细胞的效率明显增高。结论:成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步3TAT-DRBD的功能研究及临床应用奠定了基础。

• 单位
  西京医院; 中国人民解放军第四军医大学